shRNA沉默CCAT2对非小细胞肺癌耐顺铂细胞A549的影响

更新时间:2023-05-28

【摘要】目的研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默结肠癌相关转录因子2(colon cancer associated transcript 2, CCAT2)对非小细胞肺癌耐顺铂(cisplatin,DDP)细胞株(A549/DDP)的增殖、侵袭和凋亡以及体内肿瘤形成的影响。方法 shRNA-CCAT2(sh-CCAT2)或shRNA-阴性对照(shRNA-NC)转染A549/DDP细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组),通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测3组A549/DDP细胞CCAT2mRNA表达;通过MTT实验检测3组A549/DDP细胞经过不同质量浓度(0～8 mg/L)DDP处理后的增殖能力变化,并依此选定2 mg/L DDP进行后续实验。采用克隆形成实验、流式细胞法、Transwell实验检测2 mg/L DDP处理对各组细胞(并设未经处理的A549/DDP细胞为对照组)增殖、凋亡、侵袭的影响,用Western blot检测各组细胞增殖标记蛋白〔Ki67蛋白、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)〕、凋亡标记蛋白(Caspase-3、Caspase-9)、侵袭标记蛋白〔血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)〕蛋白的表达。裸鼠皮下注射A549/DDP细胞、转染shRNA-NC和转染sh-CCAT2的A549/DDP细胞,每3 d腹腔注射DDP 2 mg/kg,连续给药7次,另设对照组(皮下注射A549/DDP细胞,腹腔注射等量生理盐水)。检测每5 d肿瘤体积,共30 d。30 d后处死取肿瘤组织,RT-PCR检测CCAT2 mRNA表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡。结果与对照组和sh RNA-NC转染组相比,sh-CCAT2转染A549/DDP细胞后,细胞CCAT2 mRNA表达降低(P<0.01),2～8 mg/L DDP作用后细胞增殖抑制更明显(P<0.01)。与对照组相比,DDP处理的3组细胞克隆形成减少,增殖标记蛋白Ki67和PCNA表达减少(P<0.01);细胞凋亡率增加,凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达增多(P<0.01);细胞侵袭数目减少,侵袭标记蛋白VEGF和MMP-14表达降低(P<0.01);DDP处理的3组细胞中,sh-CCAT 2转染的细胞上述表现最为明显(P<0.01)。体内实验显示,与对照组相比,3个DDP组肿瘤体积减小,30 d时差异有统计学意义(P<0.01);肿瘤组织CCAT2 mRNA表达减少(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01)。3个DDP组中,接种sh-CCAT2转染的A549/DDP细胞组上述表现最为明显(P<0.01)。结论 sh-CCAT2可以抑制A549/DDP细胞的增殖、诱导细胞凋亡和降低细胞的侵袭能力,从而抑制A549/DDP细胞生长。

【关键词】 CCAT2 非小细胞肺癌 顺铂

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